PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Biosensor merupakan peralatan analitik yang menggabungkan antara komponen biologi (enzim) dan transduser fisika untuk mendeteksi suatu senyawa target. Diantara kelebihan biosensor adalah memiliki sensivitas dan selektivitas yang tinggi, kecepatan respon, biaya yang rendah serta pengoperasiannya yang mudah. Dengan demikinan maka biosensor menjadi suatu peralatan penting untuk mendeteksi komponen kimia dan biologi pada obat-obatan, makanan dan monitoring lingkungan (Baeumner, 2004; Amine dkk., 2006; Tudorache dkk., 2007). Biosensor yang telah dikembangkan adalah biosensor amperometri yang menggunakan enzim uricase dalam penentuan asam urat (Arslan., 2008). Contoh biosensor yang lain adalah biosensor kolorimetri dengan melakukan imobilisasi enzim glukosa oksidase (GOD) dan peroksidase dalam matriks silika secara sol-gel dengan prekursor tetraethyl orthosilicate (TEOS) dan tetramethyl orthosilicate (TMOS) untuk penentuan kadar glukosa (Liang dkk., 2008).
Imobilisasi biomolekul merupakan penyisipan biomolekul yang secara fisik ditempatkan di dalam suatu daerah/ruang tertentu, sehingga dapat menahan aktivitas katalitiknya serta dapat digunakan secara berulang-ulang (Chibata, 1978). Keberhasilan suatu biosensor tergantung pada proses imobilisasi enzim dalam suatu bahan pengemban yang diinginkan dan tetap aktif nya enzim selama digunakan (Coradin dkk., 2006). Dua aspek penting dalam pengembangan biosensor adalah penyisipan enzim dalam matriks yang sesuai dan pemantauan interaksi antara analit dan enzim (Grupta & Chaudhury., 2007). Berbagai teknik imobilisasi biomolekul telah dilakukan antara lain melalui teknik adsorbsi ( Yao dkk.,2007; Wang dkk.,2009), ikatan kovalen (Kunzelmann & Botther, 2007), dan enkapsulasi dalam polimer (Fei dkk.,2003).
Enkapsulasi merupakan salah satu bagian dari teknik penjebakan enzim kedalam suatu padatan pengemban. Penggunaan matriks silika yang dibuat dengan proses sol-gel, memberi harapan untuk enkapsulasi biomolekul seperti enzim, antibodi, dan sel. Enzim lebih stabil dalam lingkungan yang terenkapsulasi pada matriks silika karena kerangka polimeriknya berkembang disekitar biomolekul, membentuk kurungan dan mencegah enzim dari agregasi dan denaturasi (Bhatia dkk., 2000). Selain murah matriks silika juga menunjukkan kekuatan mekanik dan stabilitas termal yang tinggi. Dengan demikian, aktivitas biologi dari enzim, antibodi, dan sel yang masuk dapat dipertahankan (Nguyen dkk., 2002). Pada umumnya, biosensor enzim berbasis sol-gel dengan enkapsulasi biomolekul dalam silika gel dilakukan melalui hidrolisis dan kondensasi dari ortosilikat, seperti tetramethyl orthosilicate (TMOS) atau tetraethyl orthosilicate (TEOS) (Liang dkk.,2008). Penggunaan orthosilicate akan menghasilkan metanol atau etanol sebagai hasil samping, dan dapat mengganggu aktivitas biomolekul.
Asam urat merupakan hasil pemecahan metabolisme purin ( asam nukleat) tubuh, yang sebagian kecil berasal dari makanan. Sebagian besar asam urat diekskresikan oleh ginjal. Dalam darah, sebagian besar asam urat dalam bentuk monosodium urat. (Underwood., 1999). Telah diketahui secara luas bahwa konsentrasi asam urat yang abnormal di tubuh menunjukkan adanya gejala beberapa penyakit seperti diabetes, kolesterol tinggi, tekanan darah tinggi, penyakit ginjal dan penyakit hati. Bahkan beberapa penelitian menunjukkan bahwa kenaikan level asam urat dapat menyebabkan kenaikan resiko terkena penyakit kardiovaskular (Chen et al., 2005). Uricase merupakan enzim yang selektif terhadap asam urat, sehingga enzim uricase sering digunakan untuk menentukan kadar asam urat.
Dalam penelitian ini dilakukan imobilisasi enzim Horseradish Peroxidase (HRP) dan uricase dalam silika dengan bahan dasar natrium silika. Dengan bahan dasar ini, timbulnya alkohol dapat dihindari. Penelitian ini juga diharapkan dapat mengungkap pengaruh imobilisasi enzim HRP dan uricase dalam silika dengan bahan dasar natrium silika terhadap stabilitas dan aktivitas enzim HRP dan uricase sebagai biosensor asam urat. Serta mempelajari karakteristik biosensor yang meliputi daerah linier, limit deteksi, penggunaan ulang enzim, dan sensitivitas.
B. Perumusan Masalah
1. Identifikasi Masalah
Dalam penelitian studi imobilisasi enzim HRP-uricase pada silika secara sol gel sebagai biosensor untuk penentuan kadar asam urat terdapat beberapa masalah, antara lain:
a. Sampel yang dianalisa melalui deteksi warna jumlahnya sebanyak 96 titik untuk sekali analisis, diperlukan suatu alat deteksi warna yang dapat menganalisis untuk sampel yang banyak dengan sekali analisis.
b. Karakteristik biosensor yang baik dengan menggunakan enzim sebagai biosensor karakteristiknya antara lain : respon waktu yang cepat, daerah linier R2 mendekati nilai 1, limit deteksi sekecil mungkin , sensitivitas yang baik dengan nilai slope 1 atau lebih besar dari 1, ketahanan (penggunaan ulang enzim) dengan koefisien variasi (Cv) kurang dari 1 %. Dari karakteristik biosensor tersebut yang tidak dapat dianalisis dengan elisa reader adalah respon waktu.
c. Enzim berasal dari sumber yang berbeda-beda, dengan sumber yang berbeda-beda mamiliki sifat yang berbeda-beda. Enzim uricase berasal dari berbagai bakteri semisal enzim uricase yang berasal dari Arthrobacter globiformis, Bacillus fastidiosus, Candida sp. Enzim uricase paling banyak didapatkan dari candida sp. Untuk menghasilkan senyawa produk berwarna dari reaksi enzimatis yang menghasilkan hidrogen peroksida diperlukan enzim peroksidase yaitu enzim Horseradish Peroxidase yang bisa berasal dari isolasi akar lobak (Amoracia Rusticana) dan kultur sel tanaman horseradish (Armorachia Lapatifolia)
d. Prekursor yang digunakan dalam imobilisasi biomolekul dari material silika dapat berupa TEOS, TMOS, dan natrium silikat. Penggunaan dari TEOS dan TMOS dapat menghasilan produk berupa alkohol. Alkohol dapat mengganggu aktivitas enzim. Natrium silikat tidak menghasilkan produk berupa alkohol.
e. Proses sol-gel dari material silika dapat dilakukan pada pH tinggi dan pH rendah. Proses sol-gel pada pH rendah sekitar 4, menghasilkan gel yang lebih kuat tetapi sangat cepat terbentuk gel sehingga menyulitkan untuk memasukan enzim. Sedangkan proses sol-gel pada pH tinggi sekitar 9, gel yang dihasilkan tidak begitu kuat dan proses pembentukan gelnya lebih lama sehingga memudahkan untuk memasukan enzim.
f. Teknik imobilisasi biomolekul dapat dilakukan dengan teknik kimia (ikatan kovalen, dan ikatan silang) berpengaruh terhadap aktivitas enzim yang diimobilisasi karena akan bereaksi terlebih dahulu dengan senyawa kimia yang digunakan untuk mengimobilisasi. Teknik fisika (enkapsulasi, dan adsorbsi). Teknik adsorpsi, enzim mudah terlepas dari bahan pengemban. Teknik enkapsulasi lebih dapat menjaga aktivitas dan stabilitas enzim setelah terimobilisasi.
g. Uji aktivitas reaksi enzimatis dapat dipengaruhi oleh pH, temperatur, konsentrasi garam dalam larutan atau inhibitor.
h. Kinetika reaksi enzimatis menurut Michaelis-Menten meliputi nilai (Km) dan kecepatan maksimum yang bersifat khas terhadap enzim tertentu, dengan substrat spesifik pada kondisi pH dan temperatur tertentu.
2. Batasan Masalah
a. Analisa uji aktivitas reaksi enzimatik dengan metode deteksi warna menggunakan alat ELISA reader pada plat microwell.
b. Karakteristik biosensor dengan validasi metode menggunakan elisa reader yang berada dilaboratorium LPPT UGM meliputi daerah linier, limit deteksi, sensitivitas , dan ketahanan (penggunaan ulang enzim).
c. Enzim yang digunakan adalah enzim uricase yang berasal dari candida sp dan enzim HRP yang berasal dari kultur sel tanaman horseradish (Armorachia Lapatifolia)
d. Prekursor yang digunakan untuk imobilisasi dari natrium silikat.
e. Proses sol-gel dilakukan pada pH tinggi sekitar 9.
f. Teknik imobilisasi yang digunakan adalah enkapsulasi dalam polimer matriks silika yang dibuat dengan proses sol-gel.
g. Uji aktivitas reaksi enzimatis enzim HRP-uricase dilakukan pada kondisi pH dan temperatur tertentu.
h. Kinetika reaksi enzimatis HRP-uricase teriombilisasi pada matriks silika meliputi nilai (Km) dan kecepatan maksimum.
3. Rumusan Masalah
a. Berapakah pH optimum enzim HRP-uricase?
b. Berapakah temperatur optimum enzim HRP-uricase ?
c. Apakah enzim yang terimobilisasi pada matriks silika memiliki ketahanan termal yang lebih baik daripada enzim yang bebas?
d. Bagaimanakah karakter biosensor yang dihasilkan dengan validasi metode? meliputi :
1) Daerah linier
2) Limit deteksi
3) Sensitivitas
4) Penggunaan ulang enzim
e. Dari reaksi enzimatis HRP-uricase pada matriks silika, berapakah? :
1) Nilai ketetapan michaelis (Km)
2) Kecepatan maksimum
C. Tujuan Penelitian
Tujuan secara umum penelitian ini adalah untuk mengenkapsulasikan enzim HRP-uricase dalam silika melalui proses sol-gel dan mempelajari pengaruh derajat keasaman ( pH) dan temperatur terhadap aktivitas enzim HRP-uricase dalam proses sol-gel untuk biosensor asam urat. Secara spesifik penelitian ini diarahkan untuk
a. Mengetahui nilai pH optimum dan temperatur optimum enzim HRP-uricase ,baik yang bebas maupun yang terimobilisasi pada silika
b. Mengetahui karakter biosensor yang dihasilkan dengan validasi metode meliputi daerah linier, penentuan limit deteksi, penggunaan ulang enzim, dan sensitivitas.
c. Mengetahui nilai (Km) dan kecepatan maksimum dari kinetika enzim HRP-uricase yang terimobilisasi pada matrik silika.
D. Manfaat Penelitian
Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah:
a. Secara praktis, dapat memberikan metode alternatif biosensor asam urat dengan aktivitas enzimatis enzim HRP-uricase.
b. Secara teoritis, dapat memberikan informasi tentang penggunaan silika dalam imobilisasi enzim HRP-uricase secara sol gel sebagai biosensor asam urat. Selain itu, dapat memberikan informasi nilai pH optimum dan temperatur optimum enzim HRP-uricase yang terimobilisasi melalui proses sol-gel, karakteristik biosensor dan kinetika enzim HRP-uricase.
